T淋(lin)巴細胞（T cell）和B淋巴細胞（B cell）主(zhu)要負責(ze)適應(ying)性(xing)免疫應(ying)答，其抗原識別主(zhu)要依賴(lai)于(yu)T細胞受(shou)體(ti)（T cell receptor, TCR）和B細胞受體(ti)（B cell receptor, BCR），這兩(liang)類細(xi)胞表面(mian)分(fen)子(zi)的共同特點是(shi)其(qi)多(duo)樣(yang)性，可以(yi)識別多(duo)種多(duo)樣(yang)的抗原(yuan)分(fen)子(zi)。BCR的重鏈和(he)TCR β鏈由V、D、J、C四個基因片段組(zu)成，BCR IGL鏈(lian)和TCR α鏈由V、J、C三(san)個基因片段(duan)組(zu)成，這些基因片段(duan)在(zai)遺傳過(guo)程中發生重(zhong)組(zu)、重(zhong)排，組(zu)合成不同的(de)形式，保證了(le)受體(ti)多樣性(xing)。
傳統(tong)免疫(yi)組庫研(yan)究方(fang)式局限性較大，10x Genomics新推出的“單細胞(bao)免疫譜(pu)分析”利用其微流控芯片制備單細胞(bao)體系，選擇5’ 端接頭的(de)通(tong)用引物和(he)免疫分子恒定區(qu)的(de)巢(chao)式引物進行V(D)J富(fu)集，實(shi)現(xian)在單細胞水平，對(dui)成對(dui)的重鏈和輕鏈（B細(xi)胞）或(huo)α和β鏈（T細(xi)胞(bao)）進行全長測序(xu)，為免疫(yi)組庫全面、系統的(de)研究提供了(le)高效(xiao)的(de)技術平(ping)臺，對疾病發生(sheng)、發展的(de)分子機制研究有重要(yao)的(de)意義。
圖1. 10x Genomics單細胞系統
1 技術原理
10x Genomics單細胞(bao)免疫組庫測序是建(jian)立在GemCode技術上(shang)的微流體平臺，將帶(dai)有條形碼(ma)和引物的凝(ning)膠珠與單個細胞(bao)包裹在油滴中(zhong)；接下來在每個油滴(di)內，凝膠(jiao)珠溶(rong)解，細胞裂解釋放mRNA，通過(guo)逆轉錄產生用于測序帶條形(xing)碼的cDNA。液(ye)體油層破壞后，cDNA一分為二，后續(xu)同時(shi)進(jin)行基因(yin)表(biao)達和免疫組庫文庫構建；其(qi)中TCR或者BCR的V(D)J序列(lie)通過設計在TCR或(huo)者BCR的C區域的(de)巢式(shi)PCR引物進行富集。然后(hou)使用(yong)Illumina測序平臺對文庫進行測序檢測，即(ji)可一次性獲得大量單細(xi)胞的基因表達和免疫組庫數據，實(shi)現在單細胞水平(ping)同(tong)時對基因表達和免疫組庫的研究。
圖2. BCR測序(xu)技術流程[1]
2 樣本要求
◆ 樣(yang)品類型：新鮮(xian)人或小(xiao)鼠(shu)細胞懸液(ye)(ye)、血液(ye)(ye)（全(quan)血、PBMC等(deng)）；
◆ 細胞來源：血液提(ti)取、磁珠(zhu)富(fu)集、流(liu)式(shi)分選、組織解離；
◆ 細胞(bao)大小：小于40μm；
◆ 細胞總量(liang)：細(xi)胞(bao)懸液，一個樣(yang)本(ben)細(xi)胞(bao)起始量(liang)約1x105個；
◆ 質量要求：細(xi)胞活性大于85%，理(li)想(xiang)濃度為1000個/μl（500~2000個(ge)/μl）；
◆ 細胞(bao)培(pei)養基及緩沖(chong)液不(bu)能含有Ca2+和Mg2+等影響酶活性(xing)的物質。
3 實驗(yan)流程(cheng)
利用10x Genomics平臺完(wan)成單(dan)細胞的(de)分(fen)離、反轉(zhuan)錄成cDNA后，選(xuan)擇(ze)不同的研究(jiu)目(mu)的進行文庫構建：5’ 基(ji)因表達文庫(ku)、TCR的V(D)J文庫或和(he)BCR的V(D)J文(wen)庫。將cDNA分(fen)成2份或3份同時進行TCR/BCR的V(D)J富集、文庫構建、測序和5’ 單細(xi)(xi)胞(bao)轉錄組文庫構(gou)建(jian)、測序，獲得每個細(xi)(xi)胞(bao)表達(da)譜和V(D)J全(quan)長序列，獲得(de)數據進行細胞亞群聚類(lei)、細胞表達特征和標(biao)記(ji)分(fen)子(zi)篩選(xuan)等分(fen)析。
圖3. 實驗(yan)流程
表1. 5’ 單細胞表達(da)譜和V(D)J免疫(yi)組文(wen)庫及測(ce)序參數(shu)
4 分析內容
測序數據(ju)質量(liang)控制；
比對(dui)與注釋(shi)：樣(yang)本基本信息(xi)結果統計，樣(yang)本contig注(zhu)釋信息結果(guo)統計，樣本(ben)Consensus序列(lie)注釋信(xin)息結果(guo)統計；
Clonotype分(fen)型；
特(te)征分析：CDR3特征(zheng)分析(xi)，V/J基因特征分析，V-J Paired特征分析；
多樣(yang)本分析(xi)：樣本間Clonotype比(bi)較，Overlapping Clonotype聚類分析，Overlapping Clonotype差異分析。
5結(jie)果展示(shi)
圖(tu)4. 組 Case VGene 核酸長度分(fen)布圖 圖5. 組 Case VGene 氨(an)基(ji)酸長度分布圖
（左圖橫坐標為VGENE堿基序(xu)列長(chang)度，右圖橫(heng)坐標為VGENE氨基酸序列長度，縱坐(zuo)標為clonotype的頻(pin)率，不同(tong)顏色表示不同(tong)clonotype，彩色表示top10 clonotype，灰(hui)色表示除(chu)top 10以外(wai)的其他clonotype。）
圖6. 樣品 TCR_Sample_1 鏈TRA_TRB V-J paired頻率Circos圖(tu)
（V-J paire頻率Circos圖，最外(wai)圈弧形表(biao)示V、J基(ji)因(yin)，每個顏(yan)色(se)塊代表(biao)一種基(ji)因(yin)，基(ji)因(yin)頻(pin)率(lv)越高，色(se)塊越寬；內部(bu)色(se)塊間連(lian)接弧線表(biao)示(shi)V-J paired。）
5 技術優勢
可實現(xian)配對(dui)的重(zhong)鏈(lian)和(he)輕(qing)鏈(lian)（B細胞）或α和(he)β鏈（T細(xi)胞）的全長(chang)測序(xu)；
精確到單細胞水平，能獲(huo)得大量單細胞的(de)免疫組數據；
大(da)規模單細胞VDJ表達(da)譜測序，單個(ge)細胞(bao)成(cheng)本大(da)大(da)降低；
同時獲得(de)5’ gene expression的單(dan)細胞轉錄組(zu)數(shu)(shu)據，可與免疫組(zu)數(shu)(shu)據聯(lian)合分析
6 案(an)例分享
Single-Cell Map of Diverse Immune Phenotypes in the Breast Tumor Microenvironment
發(fa)文期刊(kan)：Cell
影(ying)響因(yin)子(zi)： 30.41
了解腫瘤微環境(jing)中免疫細(xi)胞的表型，對于癌癥(zheng)進展和免疫治(zhi)療反應的研究至關重要(yao)。研究者使用(yong)單細(xi)胞RNA測序分析了來自8位原發性乳(ru)腺(xian)癌患(huan)者的45,000個免(mian)疫(yi)(yi)細胞，同時也添加(jia)了正常乳腺組(zu)織、血液和淋巴結中的免(mian)疫(yi)(yi)細胞作對照。研究者(zhe)開發了預處理(li)流程SeQC和貝(bei)葉斯聚類和歸一化方法Biscuit，用(yong)來解決單細(xi)胞(bao)數據(ju)固有(you)(you)的計算難題。研(yan)究中觀(guan)察到正常免疫(yi)細(xi)胞(bao)與腫(zhong)瘤(liu)組(zu)織中免疫(yi)細(xi)胞(bao)之間有(you)(you)顯著(zhu)相(xiang)似性，但后者針對腫(zhong)瘤(liu)微(wei)環(huan)境出(chu)現特異性連(lian)續表(biao)型擴展。對來自另外27,000個T細胞的成(cheng)對單細胞RNA和T細胞受體（TCR）測序(xu)，結果(guo)揭(jie)示了(le)TCR組合使用對表(biao)型多樣性的影(ying)響(xiang)。研(yan)究結果支持T細(xi)胞連續(xu)活化模型，但不符合(he)癌(ai)癥中的巨噬細(xi)胞極(ji)化模型[2]。本研究結(jie)果對(dui)表(biao)征腫瘤浸潤免(mian)疫細胞具有重要意義(yi)。
圖7 分析(xi)路程圖
參考文獻：
1. Yaari, G. and S.H. Kleinstein, Practical guidelines for B-cell receptor repertoire sequencing analysis. Genome medicine, 2015. 7(1): p. 1-14.
2. Azizi, E., et al., Single-cell map of diverse immune phenotypes in the breast tumor microenvironment. Cell, 2018. 174(5): p. 1293-1308. e36.
