環狀RNA（circular RNA）是近年來發現的一類特殊的非編碼RNA，它大量存在于真核細胞胞質內，是mRNA在剪接的過程中，上游exon的5’端與下游exon的3’端剪接到一起，從而形成的首尾相接的環狀分子。
研究發現，高(gao)等(deng)(deng)動物中circRNA的(de)種類和含量遠遠超過預期(qi)。circRNA具有很多重要的(de)調(diao)控(kong)功(gong)能，如circRNA可以作為競爭性(xing)內源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）結(jie)合胞(bao)內miRNA，阻斷(duan)miRNA對其靶基(ji)因的(de)抑制作用。除此以外，circRNA也具有調(diao)控(kong)其他類型RNA、調(diao)節蛋白質活性(xing)等(deng)(deng)功(gong)能。circRNA在不(bu)同物種中具有保(bao)守(shou)性(xing)和組織表達特異性(xing)，且circRNA對RNase不(bu)敏感，因此它(ta)比線性(xing)RNA更為穩定，所以circRNA在疾(ji)病新型診斷(duan)與(yu)治療(liao)方(fang)(fang)法(fa)研發方(fang)(fang)面有巨大(da)潛力和重要意義。
實驗方案
測序平臺和方式：Illumina 平臺 PE150
數據量：12G clean data/樣
技術優勢
（1）多物種選擇：可直接對人、大鼠和小鼠樣本進行最全面的circRNA分析，亦可發現新的circRNA（其他物種需特殊評估）；
（2）高精確度：數字化信號，可預測到基因家族中相似基因以及不同可變剪切類型產生的circRNA序列信息；
（3）高覆蓋度：新一代高通量測序技術的高深度覆蓋，可以檢測到低豐度的稀有circRNA。
數據分析
（1）測序質量評估：
; 原始數據過濾統計(ji)
Clean數據堿基組成和質量分(fen)布圖(tu)
（2）比對結果統計：
比對數據Reads數分布統計
（3）circRNA鑒定：
circRNA統(tong)計(ji)列表
circRNA的長(chang)度分布
circRNA的來源分布
已知circRNA的注(zhu)釋
（4）circRNA的表達水平及差異表達分析：
circRNA的表達水(shui)平(ping)分析
circRNA的差異表達結(jie)果
兩兩樣本(ben)之(zhi)間的差異表達
樣本間共享和(he)特有(you)circRNA統計(ji)分析
（5）circRNA的來源基因分析：
circRNA來源(yuan)基因的GO富集分析(xi)
circRNA來源(yuan)基因(yin)的KEGG富(fu)集分析(xi)
（6）circRNA與miRNA的結合位點預測分析
技術流程
案例分析
案例（1）環狀RNA促進結腸癌增殖和轉移
研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)者對正常組(zu)織(zhi)和(he)(he)(he)腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤結(jie)腸組(zu)織(zhi)樣本進行(xing)了(le)(le)circRNA測序，結(jie)果(guo)發現大(da)量在(zai)(zai)腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤細(xi)(xi)胞(bao)中特異(yi)性升(sheng)高的(de)(de)(de)circRNA，其中一(yi)些(xie)circRNA得(de)(de)到了(le)(le)RT-PCR實驗結(jie)果(guo)的(de)(de)(de)驗證。研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)人員對其中一(yi)類新的(de)(de)(de)circRNA——circCCDC66的(de)(de)(de)功(gong)能(neng)進行(xing)了(le)(le)深入(ru)研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)。結(jie)果(guo)表(biao)明(ming)circCCDC66在(zai)(zai)息肉(rou)和(he)(he)(he)結(jie)腸癌(ai)(ai)中表(biao)達水平升(sheng)高，并且與(yu)不良預(yu)后相關。通過在(zai)(zai)結(jie)直腸癌(ai)(ai)細(xi)(xi)胞(bao)系(xi)中進行(xing)功(gong)能(neng)獲得(de)(de)性研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)和(he)(he)(he)功(gong)能(neng)缺失性研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)，研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)人員證明(ming)circCCDC66能(neng)夠控(kong)制(zhi)多個生(sheng)理過程，包括細(xi)(xi)胞(bao)增(zeng)殖(zhi)、遷移、侵襲和(he)(he)(he)非(fei)貼附性生(sheng)長等。進一(yi)步的(de)(de)(de)研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)表(biao)明(ming)circCCDC66通過調節一(yi)系(xi)列(lie)癌(ai)(ai)基因來發揮它的(de)(de)(de)功(gong)能(neng)，并且在(zai)(zai)異(yi)種移植(zhi)腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤模型(xing)和(he)(he)(he)原(yuan)位模型(xing)中敲低circCCDC66的(de)(de)(de)表(biao)達均能(neng)夠抑制(zhi)腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤生(sheng)長和(he)(he)(he)侵襲。
以上發(fa)(fa)現表明(ming)，環(huan)狀(zhuang)RNA在癌(ai)癥發(fa)(fa)生和轉移(yi)過程(cheng)中發(fa)(fa)揮癌(ai)基因功能(neng)。該研究為了解環(huan)狀(zhuang)RNA與癌(ai)癥之間的關系(xi)以及尋(xun)找新的癌(ai)癥治療手段提供了重(zhong)要參考信息。
圖1 circCCDC66促進結腸癌增殖
案例（2）circHIPK3通過結合miRNA來調節細胞生長
對6個(ge)正常組(zu)織和(he)7個(ge)腫瘤組(zu)織測序(xu)，共鑒定出27296個(ge)circRNA分(fen)子，超過80%的(de)環狀RNA分(fen)子起源(yuan)于外顯子（exon）區。這些(xie)circRNA在正常組(zu)織和(he)腫瘤組(zu)織中(zhong)存在表達(da)差(cha)異。進一步分(fen)析發現一個(ge)來源(yuan)于2號外顯子HIPK3的(de)circHIPK3，它存在18個(ge)結合位點能夠(gou)與9個(ge)miRNA結合，從而抑制細胞生(sheng)長。
圖1 不同組織circRNA的表達差異
圖2 七個癌組織和對應正常組織中鑒定的特異性circRNA的數目
圖3 circRNA表達豐度多維圖
參考文獻
[1] Hsiao et al. Noncoding Effects of Circular RNA CCDC66 Promote Colon Cancer Growth and Metastasis. Cancer Research, 2016.
[2] Zheng et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature Communications, 2016.
