長鏈非編碼 RNAs（long non-coding RNAs，lncRNAs）是一類長度在200nt以上且不編碼蛋白質的RNA，以帶polyA尾和不帶polyA尾兩種形式廣泛存在于各種生物體內，參與細胞內多種過程調控，具有跨物種的低保守性，組織特異性表達和豐度低等特點。
近(jin)年來的研究表(biao)明，lncRNA參與了X染色體(ti)沉默、基因組印記、染色質修飾、轉錄(lu)(lu)激活、轉錄(lu)(lu)干擾和核(he)內(nei)運輸等多種重要的調控(kong)過(guo)程(cheng)，但絕大部分lncRNA的功能目(mu)前(qian)仍不(bu)清楚。應用高通(tong)量測序(xu)技術(shu)，研究人員能夠(gou)快(kuai)速獲得與疾病或者特定(ding)生物學過(guo)程(cheng)相關的lncRNA 并進行深入研究。
實驗方案
測序策略：Illumina 平臺 PE150
數據量：12G clean data
技術優勢
（1）任意物種檢測：相對傳統芯片而言，無需預先設計特異性探針，因此無需了解物種基因或基因組信息，能夠直接對任何物種進行最全面的轉錄組分析；
（2）分辨率高：可以檢測轉錄本中單堿基的差異；
（3）檢測范圍廣：從幾個到數十萬個拷貝精確計數，可同時鑒定正常和稀有的轉錄本；
（4）信息分析廣：可以做基因差異表達分析、可變剪切、融合基因分析；新轉錄本預測及注釋。
數據分析
標準信息分析
（1）數據過濾及質量評估
（2）核糖體RNA去除率計算
（3）比對參考基因組及統計
（4）基因表達水平分析
（5）基因表達差異及聚類分析
（6）差異基因KEGG生物通路富集分析（僅限于模式物種）
（7）差異基因GO功能富集分析（僅限于模式物種）
（8）已知mRNA表達量分析
（9）已知mRNA差異表達及聚類分析
（10）已知lncRNA表達量分析
（11）已知lncRNA差異表達及聚類分析
（12）預測新lncRNA
（13）新lncRNA鑒定和表達量分析
（14）新lncRNA差異表達及聚類分析
（15）新lncRNA家族分析
（16）SNP和InDel檢測與注釋
（17）生物學重復樣品間相關性分析
（18）蛋白互作網絡分析
（19）基因融合
（20）主成份分析（PCA）
（21）特征性差異表達基因分析
（22）lncRNA保守性分析
（23）可變剪切
高級分析
（1）已知mRNA-lncRNA共表達網絡構建
（2）基因結構優化及優化基因的表達值計算
（3）eQTL分析
技術流程
案例分析
案例（1）瘦豬和肥胖豬組織中lncRNA的表達水平不同
該研究(jiu)對豬(zhu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)兩(liang)個(ge)(ge)品種(zhong)陸川和杜洛克(ke)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)肝臟、肌肉和脂(zhi)肪(fang)(fang)組(zu)織分(fen)別(bie)進(jin)(jin)行(xing)了lncRNA測(ce)序，共鑒定出4868個(ge)(ge)lncRNA轉錄(lu)本，其(qi)(qi)中(zhong)3235個(ge)(ge)為(wei)新(xin)轉錄(lu)本，而且lncRNA和mRNA的(de)(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)達模(mo)式是(shi)組(zu)織特(te)異(yi)性的(de)(de)(de)(de)(de)(de)。脂(zhi)肪(fang)(fang)組(zu)織中(zhong)差異(yi)表(biao)達的(de)(de)(de)(de)(de)(de)lncRNA具有794個(ge)(ge)潛在的(de)(de)(de)(de)(de)(de)靶基(ji)因，這些靶基(ji)因富(fu)集到脂(zhi)肪(fang)(fang)細胞因子(zi)信(xin)號(hao)通路(lu)、PI3k-Akt信(xin)號(hao)通路(lu)和鈣離子(zi)信(xin)號(hao)通路(lu)。此外，差異(yi)表(biao)達的(de)(de)(de)(de)(de)(de)lncRNA位(wei)于13個(ge)(ge)脂(zhi)肪(fang)(fang)相關的(de)(de)(de)(de)(de)(de)數量性狀(zhuang)位(wei)點(dian)，其(qi)(qi)中(zhong)包括65個(ge)(ge)QTL_ID。接著，分(fen)析了同(tong)一(yi)QTL_ID中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)lncRNA和mRNA，并通過qPCR證實(shi)了其(qi)(qi)在兩(liang)個(ge)(ge)QTL_ID中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)共表(biao)達。該研究(jiu)為(wei)兩(liang)個(ge)(ge)豬(zhu)品種(zhong)脂(zhi)肪(fang)(fang)代謝差異(yi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)子(zi)機理提供了新(xin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)觀點(dian)，為(wei)進(jin)(jin)一(yi)步研究(jiu)lncRNA在肥(fei)胖發育(yu)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)調控作用奠定了重要基(ji)礎。
圖1 組織中lncRNA和mRNA的差異表達
圖(tu)(tu)2 lncRNA和mRNA差異(yi)表達的(de)熱圖(tu)(tu)
案例（2）長非編碼RNA控制造血干細胞功能
造血干細胞(bao)(bao)（hematopoietic stem cell，HSC）具(ju)有獨(du)特的(de)(de)(de)(de)基(ji)因(yin)表(biao)達(da)程序，能(neng)夠自我(wo)更(geng)新和分化成各類成熟血細胞(bao)(bao)。長(chang)非編碼RNA（lncRNA）已成為基(ji)因(yin)表(biao)達(da)和細胞(bao)(bao)命運決定(ding)的(de)(de)(de)(de)重(zhong)要(yao)(yao)調節因(yin)子(zi)，盡管它們在(zai)HSC中的(de)(de)(de)(de)功能(neng)尚不清楚(chu)。該(gai)研究對(dui)純(chun)化的(de)(de)(de)(de)HSC進行lncRNA測序，鑒定(ding)出323個(ge)未注釋的(de)(de)(de)(de)lncRNA。比較這(zhe)些lncRNA在(zai)差異(yi)譜系(xi)中的(de)(de)(de)(de)表(biao)達(da)顯示159個(ge)lncRNA富集于(yu)HSC，其中一些可能(neng)是(shi)是(shi)HSC特異(yi)性的(de)(de)(de)(de)（LncHSC）。這(zhe)些lncRNA基(ji)因(yin)與編碼蛋白基(ji)因(yin)具(ju)有相(xiang)似(si)的(de)(de)(de)(de)表(biao)觀遺傳(chuan)(chuan)學特征，如通過DNA甲基(ji)化調節表(biao)達(da)。敲低兩種LncHSC對(dui)HSC自我(wo)更(geng)新和譜系(xi)定(ding)型產生(sheng)了的(de)(de)(de)(de)不同影(ying)響。該(gai)研究結果表(biao)明(ming)，lncRNA在(zai)HSC調控(kong)(kong)中起重(zhong)要(yao)(yao)作用，為HSC調控(kong)(kong)的(de)(de)(de)(de)遺傳(chuan)(chuan)回路(lu)提供了一個(ge)新的(de)(de)(de)(de)思路(lu)。
圖1 HSC特異的lncRNA的鑒定
參考文獻
[1] Yu et al. Comparative analyses of long non-coding RNA in lean and obese pig. Oncotarget, 2017.
[2] Luo et al. Long non-coding RNAs control hematopoietic stem cell function. Cell Stem Cell, 2015.
