16S rDNA測序是細菌(jun)基因(yin)組中編碼核糖(tang)體16S rRNA分(fen)子所對應的(de)DNA序列，序列全(quan)長約(yue)1540bp，由10個保守區和9個可(ke)變(bian)區（V1-V9）組成。保(bao)守區序列在細菌間(jian)差異不大而高變區則(ze)具有種屬特異性，因此最(zui)常用作(zuo)細菌(jun)分類(lei)標(biao)準(zhun)。通過提取環境樣品DNA，擴增其中(zhong)16S rDNA基(ji)因（常見(jian)擴增區域(yu)：V×4區、V3-V4區、V4-V5區），對(dui)片段進行高通量測(ce)序并(bing)與細(xi)菌注釋數(shu)據庫比(bi)對(dui)，從(cong)而完成對(dui)樣品細(xi)菌種類、豐度、差異菌群(qun)和(he)系統進化等諸多信息(xi)分析(xi)。這對(dui)于研究微生物菌群(qun)和(he)疾病之間(jian)的發病機制等方面發揮(hui)著重要的作用。
應(ying)用方向
1. 健康和疾病人群細菌(jun)分(fen)類鑒定、屬菌(jun)豐度統計(ji)、差異(yi)菌(jun)群Biomarker 篩選(xuan)
2. 疾病與微生物菌群之間發病機(ji)制的研究(jiu)；
實(shi)驗(yan)方(fang)案(an)
測序策略(lve): Illumina NovaSeq 6000，PE250
數據量:每個樣>5萬條(tiao)raw reads
技術(shu)優勢
1. 與微生(sheng)物傳(chuan)統鑒(jian)定(ding)方法相比，16S rDNA測序可以鑒(jian)定(ding)出許多不能(neng)純化培養的新菌種，方法簡便快捷(jie)、精確度高、重復(fu)性更好(hao)；
2. 測序數據量少，具有較低(di)的(de)成(cheng)本，性(xing)價比較高；
3. 可以針對一個或多(duo)個可變(bian)區進行序列讀取，能更(geng)準(zhun)確的(de)進行細菌分類鑒定；
4. 可(ke)以鑒定出低豐度(du)細菌，靈敏(min)度(du)更高；
技術(shu)流(liu)程
圖1 16S rDNA測序實(shi)驗流程
數據分析
(1)按標準流程進行(xing)數(shu)據整理及數(shu)據質量評(ping)估(gu);
(2) Tags拼接(jie)、過濾;
(3)物種組成分(fen)析(與(yu)RDP,Silva,GreenGene等數據庫(ku)比對) ;
(4) OTU統計及venn圖分析;
(5) OTU Rank曲線;
(6)物種積累曲線;
(7)物種注釋及其豐度分析(xi)(柱狀圖和熱圖分析(xi))
(8)物(wu)種(zhong)系(xi)統(tong)進(jin)化分析;
(9)單(dan)個樣本復雜度分析(α多樣性分析(xi));
(10)樣本間(jian)/組間α多樣性(xing)差異統計(ji)分析(xi)及盒形圖;
(11)樣品間復雜度分析: β多樣性heatmap分析;
(12) β多樣性PCoA分析(2D/3D);
(13) NMDS-2D/3D分析；
(14)樣(yang)本(ben)組間差異分析(xi): Adonis分析(xi),相似(si)性分析(xi),RDA/CCA分析等;
(15)不(bu)同樣本間(jian)物(wu)種組成聚類分析(樣品(pin)數(shu)>=3)
(16)其他高級分析:比如PICRUSt預測(ce)宏基因組的功能組成。
送(song)樣(yang)建(jian)議
樣本來源：人(ren)、大(da)鼠和小(xiao)鼠（其(qi)它樣本類型請咨詢(xun)）
糞便樣本>2g/樣
腸道(dao)內容物(wu)>100μL/樣
運輸條件：干冰運送
結(jie)果(guo)展(zhan)示
圖2 Control-vs-Teatment OTU Venn圖(tu)
（在(zai)在(zai)97%的(de)相似度下，得(de)到了(le)每(mei)個(ge)樣品的(de)OTU數(shu)，利(li)用(yong)Venn圖可以展(zhan)示多樣品共(gong)有和各(ge)自特有OTU數目(mu)，直觀(guan)展示樣(yang)品間OTU的重疊情況。結合OTU所代(dai)表(biao)的(de)物種，可以(yi)找出不(bu)同環(huan)境中的(de)核(he)心微生物。圖中不(bu)同顏色圖形(xing)代(dai)表(biao)不(bu)同樣(yang)品或者不(bu)同組別，不(bu)同顏色圖形(xing)之間交疊部(bu)分(fen)數字為兩個樣(yang)品或兩個組別之間共有的(de)OTU個數。）
圖3 樣(yang)本Phylum 水平物(wu)種豐度組(zu)成(cheng)
圖4 組間Phylum 水平物種豐度(du)組成
圖5 樣本Phylum水平物種(zhong)豐(feng)度熱圖
圖6 組間Phylum水平物種豐度熱圖
圖7 組(zu)間Alpha多(duo)樣性盒(he)形圖
（組間(jian)Alpha多樣(yang)性盒形圖，更(geng)直觀顯(xian)示(shi)組間Alpha多樣性差(cha)異。盒(he)形圖可以顯示5個(ge)統(tong)計量（最(zui)小值，第一個(ge)四分(fen)位(wei)數(shu)，中位(wei)數(shu)，第三個(ge)中位(wei)數(shu)和(he)最(zui)大值，及由下到上的(de)5條線），異常值以“o”標(biao)。）
圖8 基于LDAscore篩選的biomarker
圖9 特征物種的柱狀(zhuang)環形圖(tu)
案例分析 ：利用16S rDNA 測序對復發性膽總管結石進行微生物群分析
Microbiota analysis with next-generation 16S rDNA gene sequencing in recurrent common bile duct stones[1].
研究方案：內(nei)鏡下逆行胰膽(dan)(dan)管(guan)造影術（ERCP）是膽(dan)(dan)結(jie)石(shi)(shi)的(de)(de)主(zhu)要治療方(fang)法，但術后復(fu)發(fa)(fa)(fa)率(lv)很高。最近研究(jiu)表明膽(dan)(dan)道(dao)(dao)微生物(wu)群參與(yu)(yu)膽(dan)(dan)石(shi)(shi)癥的(de)(de)發(fa)(fa)(fa)病(bing)機(ji)制。然而膽(dan)(dan)道(dao)(dao)微生物(wu)群失調(diao)與(yu)(yu)復(fu)發(fa)(fa)(fa)性(xing)膽(dan)(dan)石(shi)(shi)癥相關性(xing)機(ji)制尚未得到研究(jiu)；本課(ke)題通(tong)過收(shou)集(ji)5例(li)復(fu)發(fa)(fa)(fa)性(xing)（CBD）結(jie)石(shi)(shi)（FF）患者(zhe)和45例(li)原發(fa)(fa)(fa)性(xing)CBD結(jie)石(shi)(shi)（YF）患者(zhe)的(de)(de)膽(dan)(dan)汁標本進行16S rDNA 測序。
研究結果：在門水平上，變形菌門（proteobacteria）和厚壁菌門（firmicutes）是主要的菌(jun)屬，FF患者的變形菌門（proteobacteria）含量比較高(gao)。此外，FF患者的擬桿菌（Bacteroidetes）和放線菌（actinobacteria）含量低。YF患者膽汁中的微生物菌群比FF患者膽汁中的分布更均勻。進一步研究發現FF患者膽汁微生物多樣性降低。在屬水平上，克雷伯氏菌（klebsiella）在FF患者中占主導地位，而埃希氏志賀氏菌（Escherichia-shigella）在YF患者中(zhong)占主導(dao)地位。此外，FF患者中(zhong)的克(ke)雷伯(bo)氏(shi)菌高(gao)于(yu)YF患者。本研究發(fa)現了(le)復(fu)(fu)發(fa)性CBD結石(shi)FF患者和(he)YF患者之間的微(wei)(wei)生物(wu)菌群(qun)在(zai)屬(shu)水平上的差(cha)異，這(zhe)為膽道(dao)微(wei)(wei)生物(wu)群(qun)變化與復(fu)(fu)發(fa)性CBD結石(shi)之間的關系提供了(le)新的見解。
圖10. YF和FF患者膽汁中微生物菌(jun)群的多樣性分析
參考文獻：Tan W, Chen R, Song J, et al. Microbiota analysis with next-generation 16S rDNA gene sequencing in recurrent common bile duct stones[J]. Annals of Translational Medicine, 2022, 10(10).
