Metagenomics(元基(ji)(ji)因(yin)組學，或者(zhe)宏(hong)基(ji)(ji)因(yin)組學)，是由 Handelman等1998年(nian)最先提出的(de)一種(zhong)直接對微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)群(qun)體中包含的(de)全部基(ji)(ji)因(yin)組信息進(jin)行(xing)(xing)研(yan)究(jiu)的(de)手段。宏(hong)基(ji)(ji)因(yin)組測(ce)序是對特定(ding)環境(jing)樣品中的(de)微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)群(qun)落基(ji)(ji)因(yin)組進(jin)行(xing)(xing)高通(tong)量測(ce)序,以(yi)分(fen)(fen)析微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)群(qun)體基(ji)(ji)因(yin)組成多樣性與豐度,探(tan)求微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)與環境(jing)以(yi)及宿主之間的(de)關系(xi),發掘(jue)和研(yan)究(jiu)新的(de)、具有(you)特定(ding)功能(neng)的(de)基(ji)(ji)因(yin)。它(ta)規(gui)避了(le)對樣品中的(de)微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)進(jin)行(xing)(xing)分(fen)(fen)離(li)培養的(de)過程，提供(gong)了(le)一種(zhong)對不可(ke)分(fen)(fen)離(li)培養的(de)微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)進(jin)行(xing)(xing)研(yan)究(jiu)的(de)途徑(jing)，更真實(shi)的(de)反應樣本中微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)組成、互作情(qing)況、系(xi)統進(jin)化等，同時在分(fen)(fen)子水平對其代謝(xie)通(tong)路、基(ji)(ji)因(yin)功能(neng)進(jin)行(xing)(xing)研(yan)究(jiu)。
應用方向
1. 健康和疾病人(ren)群細菌(jun)(jun)分類鑒定(ding)、屬菌(jun)(jun)豐度統(tong)計、差異菌(jun)(jun)群Biomarker 篩(shai)選
2. 挖掘健(jian)康(kang)和疾病(bing)人群(qun)(qun)微生物(wu)群(qun)(qun)落中(zhong)的功能基因等作(zuo)為Biomarker
3. 疾(ji)病(bing)與微生(sheng)物菌群、菌落(luo)中(zhong)的(de)功(gong)能基因關系的(de)研究
實驗方案(an)
測序平臺與方式：Illumina平(ping)臺 PE150
數據(ju)量：大于6G clean data
技術(shu)優勢
1. 單次測序產生至(zhi)少6G數據量,有利于發現特異物種信息,深度挖掘基因資源(yuan)；
2. 無(wu)需分離培養(yang)微生(sheng)物,對微生物群(qun)落多樣性(xing)和功(gong)能基因等宏觀特征進行研(yan)究,能更有效、準確的反(fan)應出(chu)微(wei)生物的真(zhen)實狀(zhuang)態(tai)；
3. 相較于16S rDNA測序，宏基因(yin)組(zu)不(bu)僅可以對細菌分類進行分析(xi)，還能(neng)進行基因(yin)和功能(neng)層面(mian)的(de)深入研究；
4. 16S rDNA測序一般注釋到屬水(shui)平，而宏基因組(zu)能(neng)鑒定(ding)到種水(shui)平甚至菌(jun)株水(shui)平，并且16S測序(xu)只擴(kuo)增了高(gao)變區的(de)(de)片段，宏(hong)基因組(zu)(zu)是將微生物基因組(zu)(zu)打斷并(bing)拼接組(zu)(zu)裝成(cheng)較(jiao)長的(de)(de)序(xu)列，可以發現更(geng)多低(di)豐(feng)度物種信息(xi),構建不(bu)同物種(zhong)之(zhi)間的代謝網絡途徑(jing)，因此在鑒定物種過程(cheng)中具有(you)更高的優勢(shi)；
技術(shu)流程
圖1 宏基因(yin)組測序實驗流程
數據分析
3.1數(shu)據質控
3.2 Metagenome組裝
3.3 基因預測
3.4 物種注釋(shi)
3.5 功能注(zhu)釋
3.6物種和功能分(fen)析
3.7抗性基因分(fen)析:獲得抗(kang)(kang)性基(ji)因(yin)豐(feng)度(du)分布(bu)情(qing)況以及(ji)這些抗(kang)(kang)性基(ji)因(yin)的物種歸屬和抗(kang)(kang)性機制
3.8其他高級分析:如(ru)CCA/RDA分析,腸型分析,拷貝數變異(CNV)分析,CAG/MLG分(fen)析,病原與宿(su)主互作數據(ju)庫(PHI)注釋,分(fen)泌蛋(dan)白預測(ce), Ⅲ型分(fen)泌系(xi)統(tong)效應蛋白(bai)預測(ce),細菌致(zhi)病菌毒力因子(VFDB)注釋,轉移(yi)元件分(fen)析(MGE)等(deng);同(tong)時,結合環境因子、病理指標(biao)或特殊表型(xing)進(jin)行深入關(guan)聯(lian)研(yan)究,能夠為(wei)進一步深(shen)入研(yan)究和利(li)用樣品的物種和功能提供理論依據。
送樣建議
樣本來源：人、大鼠(shu)和小鼠(shu)（其它樣本類型請(qing)咨詢）
人糞便樣本(ben)：>2g/樣；動物(wu)糞(fen)便＞0.5g/樣
腸道內容(rong)物樣本(ben)：200mg/樣
腸道組織(zhi)樣本：>1g/樣(yang)品，塊狀物需要黃豆樣(yang)大小 1~2 粒/樣
運(yun)輸條件：干冰運(yun)送
結(jie)果展示
圖2 各樣品Phylum水平的物種(zhong)相對豐度柱形圖
圖3 各組Phylum水平(ping)的物種相對豐度柱形圖
（從(cong)不(bu)同分類層級的相(xiang)對(dui)豐(feng)度(du)表出(chu)發，并將豐(feng)度(du) < 0.5% 的(de)物種(zhong)設(she)置為(wei) Others，繪(hui)制出各樣(yang)品對應的物種注釋結果在(zai)不(bu)同分(fen)類層級上的相對豐度(du)柱形圖）
圖(tu)4 各樣品Phylum水平(ping)的物種相對(dui)豐(feng)度熱(re)圖
圖5 各組(zu)Phylum水平的物種相對(dui)豐度熱(re)圖
（從(cong)不同分(fen)類層(ceng)級的(de)相對豐度表出發(fa)，每個樣(yang)品中(zhong)的(de)豐度信息繪制熱圖，并從(cong)物種層(ceng)面進行聚類，便(bian)于(yu)結果展示(shi)和信息發(fa)現，從(cong)而找出樣(yang)品中(zhong)聚集較多的(de)物種）
圖(tu)6 基于LDA score篩(shai)選的biomarker
圖7 特征物種的(de)柱狀環形圖
圖8 KEGG注(zhu)釋基因數(shu)目統(tong)計(ji)圖
案例分析(xi) ：利用(yong)宏基(ji)因(yin)組新一代(dai)測序技(ji)術洞察(cha)肺結核患者(zhe)獨特的肺菌群圖譜
Insights into the Unique Lung Microbiota Profile of Pulmonary Tuberculosis Patients Using Metagenomic Next-Generation Sequencing[1]
研究方案：為探究(jiu)與肺(fei)結核相關的(de)微生(sheng)物群(qun)分布(bu)情況(kuang)，并研究(jiu)抗結核治(zhi)療期間的(de)縱(zong)向變化，研究(jiu)者采集8 名健康人(ren)(HCG)、12 名未治(zhi)(zhi)療(liao)的(de)肺(fei)(fei)(fei)(fei)結(jie)核(he)患者(zhe)(UTG)、15 名已治(zhi)(zhi)療(liao)的(de)肺(fei)(fei)(fei)(fei)結(jie)核(he)患者(zhe)(TTG)、11 名治(zhi)(zhi)愈的(de)肺(fei)(fei)(fei)(fei)結(jie)核(he)患者(zhe)(CTG)和 7 名肺(fei)(fei)(fei)(fei)癌患者(zhe)（LCG）的(de)支氣(qi)管肺(fei)(fei)(fei)(fei)泡灌洗液（BALF）樣本，并在(zai)健康對(dui)照組(zu)中(zhong)采集(ji)咽(yan)拭子。利用metagenomic sequencing分(fen)析(xi)比較指定組(zu)中(zhong)微(wei)生物(wu)群(qun)(qun)的(de)差異，對(dui)結(jie)核(he)病患者(zhe)的(de)肺(fei)(fei)(fei)(fei)部微(wei)生物(wu)群(qun)(qun)進(jin)行了表征，并評估(gu)抗結(jie)核(he)治(zhi)(zhi)療(liao)對(dui)肺(fei)(fei)(fei)(fei)微(wei)生物(wu)群(qun)(qun)的(de)影響。
研究結果：本研究對所有隊列數據進行了主坐標（CAP）分析，發現在屬和種水平上，咽拭子和 BALF 樣本之間的微生物群組成存在明顯分離。為了研究上呼吸道和下呼吸道微生物群的差異，研究者比較了健康對照的咽拭子和 BALF 間的微生物群，發現咽拭子中的ACE指數和Chao1指數在種和屬水平上均遠高于BALF，香農指數在種水平上顯著高于BALF，但在屬水平上無顯著差異，而辛普森指數在種或屬水平上這兩組樣本之間沒有顯著差異。主坐標分析 (PCoA) 顯示，在種和屬水平上，BALF 簇與咽拭子簇明顯分離，表明上呼吸道和下呼吸道之間的微生物群組成不同。進一步研究者分析了咽拭子和 BALF 間相對豐度top 30的物種，發現咽拭子和BALF中top30的細菌分別占細菌總數的61.58%和84.03%，其中，Klebsiella pneumoniae、Staphylococcus aureus、Pasteurella multocida是三組中的優勢物種。為了研究長期抗結核治療后治愈的結核病患者的肺微生物群的變化機制，研究者比較了HCG和CTG之間的微生物組成，發現2組的多樣性指數沒有顯著差異，通過LEfSe分析（LDA SCORE>2.0）也并未發現兩組之間有存在差異的物種，結果表明治愈的結核病患者表現出與健康人相似的肺微生物群結構和組成。進一步研究發現CTG比HCG顯示出更多的多樣性和豐富的ARGs，并在 cooccurrence network中顯示CTG中細菌和ARGs的連接要比HCG中的復雜。結果表明，肺(fei)結核患者(zhe)區別于健康個體(ti)和肺(fei)癌(ai)患者(zhe)表現出獨特的微生物組成，抗結核病治療增加了肺(fei)微生物群的α多(duo)樣(yang)性并影響了(le)β多(duo)樣(yang)性，加速了(le)ARGs的(de)富集。通過對肺部微生物群進(jin)行分析比較有助于更(geng)好(hao)地了解肺結核(he)的(de)發病機制。
圖9 所有樣本中的菌群情(qing)況
圖(tu)10 來自(zi)健康對照(zhao)組的咽拭子和(he)BALF樣本(ben)之間的菌群分(fen)布有顯著差異
參(can)考文獻：Xiao G, Cai Z, Guo Q, et al. Insights into the Unique Lung Microbiota Profile of Pulmonary Tuberculosis Patients Using Metagenomic Next-Generation Sequencing[J]. Microbiology spectrum, 2022, 10(1): e01901-21.
