DNA甲基化(hua)研(yan)究一直是疾病研(yan)究的熱點,與基因表達(da)、表型性狀(zhuang)息息相關。是基因調控的手段之一,通過對位(wei)于(yu)啟動(dong)子及基因區(qu)CpG島的甲基化(hua)而抑制基因的表達(da)。在維持細胞正常功能(neng)、傳遞基因組印記,胚胎(tai)發(fa)育、腫瘤發(fa)生等方面起著至關重要的作用(yong)。
RRBS(Reduced Representation Bisulfite Sequencing)是一種準確且高性價比的DNA甲基化研究方法,在大規模臨床樣本的研究中有著廣泛的應用。RRBS通過限制性內切酶對基因組進行酶切,富集啟動子及CpG島區域,再進行Bisulfite轉化, 結合(he)Illumina高(gao)通量平臺測(ce)序，是一(yi)種高(gao)性(xing)價(jia)比測(ce)序方法。用較小的(de)數據量得到(dao)包含(han)最多CpG位(wei)點甲基化信息的(de)單堿基精度(du)的(de)甲基化圖譜。
應用方向
1. 隊列(lie)研(yan)究、疾病(bing)(bing)分子分型、臨床樣本(ben)的(de)甲(jia)基(ji)化 Biomarker 篩選; 復(fu)雜(za)疾病(bing)(bing)及(ji)腫(zhong)瘤發病(bing)(bing)機制等甲(jia)基(ji)化研(yan)究;
2. 模式動(dong)物發育和疾(ji)病甲基(ji)化研究;
3. 動物遺傳育(yu)(yu)種及進化發(fa)育(yu)(yu)等甲基(ji)化研究;
技術優勢
1. Bisulfite 結合(he) NGS 測序(xu)(xu), 單(dan)堿基分辨(bian)率(lv), 最高性價比，金標(biao)準方案; 富集 CpG 島和啟動子區(qu)域(yu)等(deng)重要區(qu)域(yu)，測序(xu)(xu)目標(biao)性強，增加(jia)測序(xu)(xu)深(shen)度;
2. RRBS 可以(yi)檢測(ce)高達(da) 6-9M 以(yi)上人(ren)基因組(zu) CpG 位點; 廣泛適合于(yu)人(ren)、哺乳動物、其他動物及魚類的物種(zhong);
3. 先進的(de)測序平臺，采(cai)用(yong)DNBSEQ-T7測序平臺，結果(guo)更可靠
4. 單堿(jian)基分辨率，做到甲基化位點(dian)的定性(xing)和相(xiang)對定量(liang)分析
技術流程
圖(tu)1 RRBS實驗(yan)流程
送樣建議
樣本(ben)(ben)來(lai)源(yuan)：人、大鼠(shu)和小鼠(shu)（其他樣本(ben)(ben)類型請咨詢）
動物新鮮冷(leng)凍組織樣(yang)本1-2g
新鮮或凍存細(xi)胞系樣本≥10^7個cell
基因組DNA：總(zong)量(liang)≥ 6ug; 濃度(du)≥ 50ng/ul; 完整性好(hao)
備注：不(bu)適合 FFPE、cfDNA 等片段化樣(yang)本(ben)
結果展示
圖2 甲基(ji)化C位(wei)點比(bi)例分布圖
圖(tu)3 染色體水(shui)平甲基化(hua)分布(bu)
(將全基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)組(zu)按照500kb的長度劃分(fen)成了(le)若干窗口，分(fen)別統計(ji)了(le)每個窗口中的GC含量, gene密度(即基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)的數目), CG甲基(ji)(ji)(ji)(ji)化(hua)水(shui)(shui)(shui)平(ping)(ping), CHG甲基(ji)(ji)(ji)(ji)化(hua)水(shui)(shui)(shui)平(ping)(ping), CHH甲基(ji)(ji)(ji)(ji)化(hua)水(shui)(shui)(shui)平(ping)(ping)，用于(yu)circos繪(hui)制。整個圖中，除(chu)了(le)最(zui)外(wai)(wai)圈(quan)染色(se)(se)體核型的標簽之(zhi)外(wai)(wai)，從外(wai)(wai)到內的5個heatmap色(se)(se)條，分(fen)別表示的是：GC含量(green), gene密度(red), CG甲基(ji)(ji)(ji)(ji)化(hua)水(shui)(shui)(shui)平(ping)(ping)(purple), CHG甲基(ji)(ji)(ji)(ji)化(hua)水(shui)(shui)(shui)平(ping)(ping)(orange), CHH甲基(ji)(ji)(ji)(ji)化(hua)水(shui)(shui)(shui)平(ping)(ping)(light blue)。其中顏色(se)(se)越深(shen)表示，密度或者水(shui)(shui)(shui)平(ping)(ping)越高。)
圖4 DMR在錨定區域數(shu)量分(fen)布比例圖（以CG-DMR為(wei)例）
圖5 富(fu)集的(de)KEGG通(tong)路的散(san)點圖(以比較組Female-vs-Male為例)
(縱(zong)軸(zhou)表示(shi)pathway名稱，橫(heng)軸(zhou)表示(shi)fold change，點的大(da)小表示(shi)此pathway中DMR相關基因個數多少，而(er)點的顏色對應(ying)于(yu)不(bu)同的Qvalue范(fan)圍(wei))
案例(li)分析 ：癌(ai)前(qian)病變到浸潤性肺(fei)腺癌(ai) DNA 甲基組的(de)演變
Evolution of DNA methylome from precancerous lesions to invasive lung adenocarcinomas[1].
研究方案：在肺腺癌(ai)的早期癌(ai)變過程中 DNA 甲(jia)基(ji)化譜和甲(jia)基(ji)化腫瘤(liu)內異質性(ITH)的演變尚(shang)未得到系統的研究(jiu); 本課題通過 RRBS 方案(an)對(dui) 124 個手術(shu)切除(chu)樣(yang)本(14 個非(fei)典型腺瘤(liu)性增生AAH; 15 個原位腺癌(ai)(ai) AIS; 22 個微侵襲性腺癌(ai)(ai) MIA 和 11 個侵襲性腺癌(ai)(ai) ADC 及病灶旁樣(yang)本)進行單堿基(ji)分辨率的甲(jia)基(ji)化測序。
研究結果：1) 在晚(wan)(wan)期(qi)病變(bian)(bian)中(zhong)甲(jia)基(ji)(ji)(ji)化(hua)變(bian)(bian)異(yi)(yi)逐漸增(zeng)加(jia)，甲(jia)基(ji)(ji)(ji)化(hua)水(shui)平明顯升高; 2) 從甲(jia)基(ji)(ji)(ji)化(hua)變(bian)(bian)異(yi)(yi)推斷(duan)的(de)(de)系統發育模式類似于基(ji)(ji)(ji)于體(ti)(ti)細(xi)胞突變(bian)(bian)的(de)(de)模式，表(biao)明 DNA 甲(jia)基(ji)(ji)(ji)化(hua)和體(ti)(ti)細(xi)胞突變(bian)(bian)的(de)(de)演化(hua)是平行的(de)(de); 3) 在晚(wan)(wan)期(qi)疾病中(zhong) T 調節(jie)細(xi)胞與 CD8+T 細(xi)胞的(de)(de)比率(lv)較(jiao)高，這(zhe)意(yi)味(wei)著(zhu)隨著(zhu)腫(zhong)瘤(liu)進(jin)展免疫抑(yi) 制；4) 全局低甲(jia)基(ji)(ji)(ji)化(hua)增(zeng)加(jia)與更高的(de)(de)突變(bian)(bian)負擔、拷貝數變(bian)(bian)異(yi)(yi)負擔和更高的(de)(de) Treg/CD8 比率(lv)相(xiang)關， 表(biao)明 DNA 甲(jia)基(ji)(ji)(ji)化(hua)在肺腺癌早期(qi)癌變(bian)(bian)過程中(zhong)對染色體(ti)(ti)不(bu)穩定性、突變(bian)(bian)和腫(zhong)瘤(liu)免疫微(wei)環境的(de)(de)潛在影響。
圖 6. DNA 甲基(ji)化變化隨癌前病變的進展而增加
參考文獻：Hu, X., et al., Evolution of DNA methylome from precancerous lesions to invasive lung adenocarcinomas. Nat Commun, 2021. 12(1): p. 687.
