miRNA是(shi)一類高度(du)保守(shou)的小RNA分(fen)子，它可以(yi)參與(yu)基因表達(da)與(yu)調控、RNA的加工(gong)與剪切(qie)、蛋(dan)白(bai)質翻譯、遺(yi)傳“入侵”抑制、配子(zi)(zi)發生等重(zhong)要生物學(xue)過程，是生命(ming)活(huo)動中必(bi)不可少的調控因子(zi)(zi)。miRNA測序技(ji)術采(cai)用(yong)膠分離技(ji)術，收集樣本中(zhong)18-30nt的RNA片段，利用高(gao)通量測序技術對(dui)樣本中所有(you)small RNA家族進行測(ce)序(xu)和表達定量，從而(er)解析(xi)miRNA 、siRNA 、piRNA 其它非編碼RNA等(deng)序列，并(bing)預測新的小RNA及其(qi)靶基因(yin)。
1、實(shi)驗方案
測序策(ce)略：Illumina 平(ping)臺 SE50
數(shu)據量：10M clean reads
2、技術優勢
（1）通量高：一次測序得到(dao)上千(qian)萬條序列；
（2）分辨率(lv)高：可以檢測(ce)小RNA單(dan)個堿基的差異；
（3）精準度(du)高：從幾個到幾十萬個拷(kao)貝(bei)精確(que)計數；
（4）可重復性(xing)好：深(shen)度測序保證(zheng)了抽樣隨機性(xing)，重復性(xing)好，無需(xu)重復實驗；
（5）檢測(ce)范圍廣：既能鑒(jian)定已知小RNA，又能發現新的(de)小(xiao)RNA。
3、信息分(fen)析
3.1 標準信(xin)息分析
（1）按標準流程(cheng)進行(xing)數據整理及數據質量(liang)評估(gu)；
（2）樣品(pin)間的公共序(xu)列和特異序(xu)列分析；
（3）小RNA與參考(kao)基因(yin)組比(bi)對(dui)分析；
（4）按照優先級(ji)將(jiang)小RNA進(jin)行分類(lei)注釋
（5）Novel Small RNA預測(ce)；
（6）樣(yang)本間miRNA差異(yi)表(biao)達分析；
（7）已知miRNA的家族(zu)分析；
（8）已(yi)知miRNA差異分析（≥2個樣(yang)本(ben)）和(he)聚類分析（≥3個樣本）；
（9）已知miRNA和novel miRNA的靶基因預(yu)測；
（10）已(yi)知(zhi)miRNA和(he)novel miRNA的(de)靶基(ji)因GO注釋和(he)KEGG通路分析；
（11）novel miRNA差異分析（≥2個樣本）和聚類分析（≥3個樣(yang)本）；
（12）差異(yi)miRNA靶(ba)基因(yin)預測；
（13）已知(zhi)miRNA的堿基編輯分析(xi)；
3.2 高級信(xin)息分析
（1）snoRNA注釋
（2）piRNA注釋
（3）mir2disease注釋
4、技(ji)術流(liu)程
5、案例分(fen)析
案例(li)（1）小鼠(shu)早期胚胎發(fa)育過程中小RNA的(de)動(dong)態變化及其生物(wu)學功能
該研究利(li)用優化的方(fang)法系(xi)統解析了小(xiao)鼠卵子到受(shou)精(jing)后8細(xi)胞胚(pei)胎發育(yu)過程中的小RNA動(dong)態變化，發現小(xiao)鼠(shu)卵(luan)子和早期胚胎主要(yao)包含(han)三(san)類小(xiao)RNA：endo-siRNA、piRNA和(he)miRNA。受精卵中的這三(san)類小RNA絕大多(duo)數來源于(yu)卵(luan)子，由(you)精子帶入卵(luan)子的(de)小RNA不足(zu)幾百分之一(yi)。隨著胚胎的(de)發(fa)育(yu)，母源endo-siRNA和piRNA逐漸(jian)被緩慢降解。而母源(yuan)miRNA的(de)降解(jie)較(jiao)快，主要發(fa)生在胚胎(tai)2細胞期(qi)前后(hou)。合子中(zhong)新表(biao)達的(de)miRNA最早(zao)出現在受(shou)精(jing)卵第一次分裂前，并隨著(zhu)胚胎的(de)發育持續被激活表達，特別是進化保守的(de)miRNA的表(biao)達(da)量迅(xun)速上升(sheng)。研究人(ren)員進(jin)一步結合小(xiao)鼠(shu)早期胚胎發育的轉錄組數(shu)據(ju)進(jin)行(xing)分(fen)析(xi)，發現miRNA在(zai)卵子到胚(pei)胎(tai)2細胞(bao)期中幾乎沒有降解靶基因mRNA的功能，而在4-8細胞期中miRNA降解靶基因mRNA的功能開始逐步恢復(fu)，并對合子激活表達的基因有明顯的靶向抑(yi)制作用。以上研究(jiu)不(bu)僅揭示了小鼠早期胚(pei)胎發育(yu)中miRNA的表(biao)達和降解(jie)規(gui)律，還(huan)發現了(le)miRNA對(dui)靶基因(yin)的調控(kong)活性隨(sui)著胚胎發(fa)育(yu)而被(bei)動態調控(kong)的現象，對(dui)于理解miRNA在(zai)早(zao)期胚胎發育中(zhong)的功能(neng)和機制具有重要意(yi)義。
案例（2）人前列腺(xian)上皮和(he)間質(zhi)細胞(bao)小RNA深度測(ce)序展示(shi)miRNA的差(cha)異類型并首次預測靶點(dian)生長因子
本研(yan)究通過(guo)高通量(liang)測序方法對小RNA長度進行(xing)分類，繪制前列腺上(shang)皮（PrEC）和間(jian)質細胞（PrSC）miRNA圖譜。PrEC測序(xu)共得到近76M reads，其中860468條為特(te)異性序列。PrSC測序得到近76M reads，其中1百萬(wan)條為(wei)特異性(xing)序(xu)列(lie)。鑒定(ding)得到許多(duo)高度保(bao)(bao)守(shou)及不保(bao)(bao)守(shou)的miRNA家族(zu)。與PrEC相比(bi)，16條在PrSC中顯著高表達的miRNA得到進(jin)一步分(fen)析。結果表明，這16條miRNA的靶點基因(yin)主要涉(she)及附(fu)著(zhu)(zhu)連接、細胞附(fu)著(zhu)(zhu)、EGRF、TGF-β和雄(xiong)激(ji)素信號。腫瘤抑制Let-7家族miRNA在兩(liang)株(zhu)細胞中高度表達。此外，鑒定得到PrEC和(he)PrSC細(xi)胞中特異性表達的miRNA，預測它們(men)的作用靶點為一組轉(zhuan)錄因子。
參考文獻
[1] Yang et al. Highly sensitive sequencing reveals dynamic modifications and activities of small RNAs in mouse oocytes and early embryos. Science Advances, 2016.
[2] Singh et al. Deep sequencing of small RNA libraries from human prostate epithelial and stromal cells reveal distinct pattern of microRNAs primarily predicted to target growth factors. Cancer Letters, 2016.
