外顯(xian)(xian)子組測序是(shi)指利用(yong)高(gao)效的序列捕(bu)獲(huo)技術將(jiang)基因(yin)組中的外顯(xian)(xian)子區域捕(bu)獲(huo)后進行高(gao)通量測序的方法(fa)。在人(ren)類基因(yin)中大(da)約有180,000個外顯(xian)子，雖(sui)然外顯(xian)子組(zu)僅占(zhan)人類基因組(zu)的1%（約30MB），但是約85%的(de)致病(bing)突變(bian)發生在(zai)外顯子組區域。外顯子組測序主(zhu)要用于識別和研(yan)究與疾(ji)病(bing)、種群進化相關的(de)編碼區及UTR區(qu)域(yu)內的(de)(de)結構(gou)變異(yi)(yi)。結合(he)大量的(de)(de)公共數(shu)(shu)據(ju)庫提供的(de)(de)外顯子(zi)(zi)(zi)數(shu)(shu)據(ju)，能夠(gou)(gou)更(geng)好(hao)地解(jie)釋所得變異(yi)(yi)結構(gou)之間(jian)的(de)(de)關(guan)聯和致病(bing)機理(li)。相比傳統方法，外顯子(zi)(zi)(zi)組(zu)測(ce)序能夠(gou)(gou)更(geng)經(jing)濟高(gao)效(xiao)的(de)(de)檢測(ce)外顯子(zi)(zi)(zi)區(qu)域(yu)的(de)(de)變異(yi)(yi)情況(kuang)，以此來為臨床診斷和個體化用藥服務(wu)。外顯子(zi)(zi)(zi)組(zu)測(ce)序目前已被廣(guang)泛的(de)(de)應(ying)用于各(ge)種癌癥、單基因病(bing)、復雜疾病(bing)和罕見(jian)遺(yi)傳病(bing)等研究(jiu)中。
1、實驗方案
捕獲(huo)平(ping)臺：Agilent SureSelect Human All Exon V6（最(zui)新捕獲(huo)試(shi)劑盒）
測序(xu)策略(lve)：Illumina NextSeq 500或HiSeq 3000 PE150
數據量：推薦(jian)100×以上(shang)的深度測(ce)序(xu)，約10G clean data
2、技術優勢
（1）高(gao)覆蓋度(du)：同等費用下獲得(de)更高(gao)深(shen)度(du)測序(xu)，SNP檢出率99%；
（2）更高通量：適合大樣(yang)本量的(de)研究；
（3）經濟高(gao)效(xiao)：相(xiang)比于全基(ji)因組重測序(xu)，更加(jia)經濟、高(gao)效(xiao)；
（4）周期短：加快文章(zhang)發(fa)表與加速臨床應用。
3、數據分析(xi)
3.1 標準信息分析
（1）按標準流程進行(xing)數據整(zheng)理及(ji)數據質量(liang)評估；
（2）與參考序(xu)列進行比對(dui)、統計測(ce)序(xu)深(shen)度及覆蓋度；
（3）SNP和InDel變異信(xin)息檢測；
（4）SNP和InDel變異所(suo)在基因的(de)功能(neng)注釋(shi)（GO、Pathway）；
（5）CNV檢(jian)測和注釋分析(xi)；
（6）變異基因(yin)保(bao)守性預(yu)測及致病性分析（SIFT、Polyphen-2、GERP）；
3.2 高級信息分(fen)析
（1）癌基因/抑癌基因/易感基(ji)因篩查；
（2）高頻(pin)突變基因統計及通(tong)路富集(ji)分析；
（3）NMF突變(bian)特(te)征及突變(bian)頻率(lv)分(fen)析；
（4）已(yi)知驅動(dong)基因(yin)篩選；
（5）基因組(zu)變異Circos圖展示。
4、捕獲平臺(tai)介紹(shao)
Agilent SureSelect Human All Exon V5 特點如(ru)下：
（1） 捕(bu)獲(huo)范圍(wei)為50Mb，包括21,522條基因的(de)357,999個外顯子(zi)區(qu)域；
（2） 根據(ju)CCDS、RefSeq、GENECODE、miRNABase、TCGA及(ji)UCSC數據庫(ku)設計(ji)探(tan)針，可有效獲(huo)得外(wai)顯子區及其周邊(bian)區域的變異信息。
（3）周期短，僅需(xu)1.5天，測序樣(yang)品(pin)便可準備就緒。
5、技術(shu)流(liu)程
6、案例分析
案例（1）外顯子組測序揭示(shi)結直腸癌耐(nai)藥新(xin)機制(zhi)
該(gai)研究通過對(dui)(dui)129個結直腸癌(ai)(ai)小鼠進(jin)行外顯子測序(xu)以及(ji)拷貝數變異分析，對(dui)(dui)55個人類腫瘤樣本進(jin)行目標區域測序(xu)，鑒別出了晚期大腸癌(ai)(ai)中與耐(nai)藥和藥物敏感(gan)性相(xiang)關的(de)(de)(de)6個基因(yin)(yin)的(de)(de)(de)新突變， ERBB2，EGFR，FGFR1，PDGFRA，MAP2K1和IRS2，并揭(jie)示(shi)出了對(dui)(dui)西妥昔(xi)單治療抗產生耐(nai)藥的(de)(de)(de)新機制。這項(xiang)研究證實替身可為在人類癌(ai)(ai)癥中評估靶向療法(fa)及(ji)將這些反應(ying)與潛在基因(yin)(yin)組學(xue)關聯起來提供(gong)一種系(xi)統的(de)(de)(de)途徑(jing)。在替身中取(qu)得成(cheng)功(gong)的(de)(de)(de)療法(fa)或(huo)許可以指導個體患者的(de)(de)(de)新療法(fa)及(ji)幫(bang)助(zhu)藥物開發。
圖1 不同體細胞(bao)突變對(dui)西妥昔單抗治(zhi)療(liao)腫瘤的(de)(de)增長的(de)(de)影響
案例(li)（2）遺傳及化(hua)學(xue)誘(you)導的KRAS驅動的肺癌基因突變全景圖
對非小細胞肺癌模型的小鼠進行外顯子測序。KrasLA2誘發(fa)的(de)肺癌(ai)比致(zhi)癌(ai)物(wu)質誘發(fa)的(de)肺癌(ai)有(you)顯著水(shui)平的(de)非整(zheng)倍體以及拷貝數變異（CNV），這表(biao)明化學物質誘導(dao)的腫瘤與轉基因模型擁有不一樣的腫瘤發生發展進程。
圖1遺傳和(he)化學誘導肺癌樣本的拷(kao)貝數情況
圖(tu)2 發(fa)生在(zai)致(zhi)癌物誘(you)導(dao)腫瘤中的驅動SNV
案例（3）外顯子組(zu)測(ce)序發(fa)現皮膚基(ji)底細胞(bao)癌(ai)的(de)新(xin)的(de)驅動基(ji)因和發(fa)展路經
皮膚基底細胞癌（BCC）是(shi)最常見的一種癌癥，90%的人(ren)都存在發病風險，尤其是年齡大和(he)紫(zi)外線照射(she)多(duo)的人(ren)。研究人(ren)員測(ce)序了236名患者的293個(ge)皮(pi)膚(fu)基(ji)底細胞(bao)癌(ai)（BCC）的(de)腫瘤樣本，并將測序結果與患者健康(kang)細(xi)胞的(de)遺(yi)傳學圖(tu)譜進行比(bi)較，發現(xian)了MYCN、PTPN14和LATS1都是(shi)BCC的驅動基因。進一步研究(jiu)表明，這些癌癥(zheng)驅動子也存在于Gorlin綜合(he)征中，這可能就是Gorlin綜合征患者(zhe)更容易患BCC的原因。
圖1 BCC的突變全景圖
參考(kao)文獻
[1] Bertotti et al. The genomic landscape of response to EGFR blockade in colorectal cancer. Nature, 2015.
[2] Westcott et al. The mutational landscapes of genetic and chemical models of Kras-driven lung cancer. Nature, 2015.
[3] Bonilla et al. Genomic analysis identifies new drivers and progression pathways in skin basal cell carcinoma. Nat Genet, 2016.
