RNA Immunoprecipitation (RIP) 是(shi)研究細胞內RNA與蛋白結(jie)合情況的(de)技術(shu)(shu)，是(shi)了解轉錄后調控(kong)網絡動(dong)態過程(cheng)的(de)有力工具(ju)，能更有效地發現miRNA的(de)調節靶點(dian)。RIP-seq技術(shu)(shu)使用(yong)特異性抗體對RNA結(jie)合蛋白或者特殊修(xiu)飾的(de)RNA進行免(mian)疫(yi)共沉(chen)淀后，分(fen)離(li)純化RNA，通(tong)(tong)過高通(tong)(tong)量測序和(he)分(fen)析(xi)，深度解析(xi)與目標蛋白相互結(jie)合的(de)RNA的(de)區域或種類。
應用方向
(1)驗證RNA與靶蛋白的相互作用
(2)在全轉錄組范圍內鑒定RNA與RBP的相互作用網絡
(3)分析RBP與miRNA、lncRNA等非編碼RNA的相互作用
技(ji)術優(you)勢
（1）全轉錄組覆蓋：與RIP芯片相比，可在全轉錄組范圍對蛋白結合位點進行篩選與鑒定；
（2）高靈敏度：每個樣本可獲得數百萬條的序列標簽，可發現研究轉錄組上稀有的蛋白結合位點；
（3）高精確率：可獲得高水平的信噪比數據，準確區分真實事件與噪音，精確定位蛋白結合位點；
（4）重復性好：深度測序保證了檢測隨機性，可不需技術重復。
生信分析流程
標準信息分析
（1）將reads比對到基因組：將預處理reads與reference genome進行mapping，最后得到mapping的sam結果文件，給出mapping結果統計；
（2）peak detect：應用sam文件進行peak富集區查找；
（3）motif detect：查找結合位點區結構特性，尋找轉錄因子結合區域的motif結構；
（4）基因關聯：應用結合位點區位置，確定其周圍所涉及的基因；
（5）關聯基因GO差異分析：以參考基因組為背景集對結合位點關聯基因進行GO富集分析。
技術流程
樣本要求
RIP捕獲的RNA>500ng，濃度>30ng/μL，OD260/280為1.8-2.0，OD260/230為1.5-1.8。
項目周期
標準流程(cheng)完成時間為50個(ge)工(gong)作日。
案例分析
案例（1）Rocaglates把DEAD-box蛋白eIF4A運輸到序列選擇性翻譯抑制物
Rocaglamide A（RocA）代表一類能夠選擇性殺傷非整倍體腫瘤細胞和抑制特殊mRNA翻譯的蛋白合成抑制劑。RocA作用于真核起始因子4A(eIF4A)，一種ATP依賴性的DEAD-box RNA解旋酶；它的mRNA選擇性是作用于高度結構化的5’非翻譯區，這一過程高度依賴于eIF4A-調節的解旋反應。然而，美國加州大學分子與細胞生物學系研究人員利用Rip-seq技術研究發現：Rocaglate（藥物）治療也許并不能從表現形式上復制eIF4A活性的缺失導致的缺陷，因為這藥物實際上只是增加了eIF4A和RNA的親和力。特別說明的是5’非翻譯區的二級結構對于RocA選擇性而言只是一個次要的決定因素，同時該RocA不會通過降低eIF4A有效性來抑制翻譯。相反，在體外和細胞中，RocA以ATP非依賴性的方式特異性地將eIF4A夾送到polypurine序列中。本研究通過這個重要的抗癌化合物來闡明了選擇性翻譯抑制的重要機理。
圖1 由RocA選擇(ze)性翻(fan)譯抑制(zhi)導(dao)致的(de)作用于(yu)eIF4A的(de)RNA序(xu)列選擇(ze)性改變
參考文獻
[1] Iwasaki et al. Rocaglates convert DEAD-box protein eIF4A into a sequence-selective translational repressor. Nature, 2016.
