華銀(yin)精準(zhun)醫療服務——免疫組庫測序及分(fen)析
2016-06-17 閱讀數(shu)：18418
免(mian)疫(yi)組(zu)庫(ku)(Immune Repertoire，IR)是指某個(ge)個(ge)體(ti)(ti)(ti)在(zai)任何特定時間點其循環系(xi)統(tong)中所(suo)有功能多樣性B淋巴細(xi)(xi)胞(bao)和(he)T淋巴細(xi)(xi)胞(bao)的(de)總和(he)。T細(xi)(xi)胞(bao)和(he)B細(xi)(xi)胞(bao)分(fen)別介導(dao)機體(ti)(ti)(ti)的(de)細(xi)(xi)胞(bao)免(mian)疫(yi)和(he)體(ti)(ti)(ti)液(ye)免(mian)疫(yi)應答，分(fen)別通過(guo)其表面的(de)T細(xi)(xi)胞(bao)受體(ti)(ti)(ti)（TCR）和(he)B細(xi)(xi)胞(bao)受體(ti)(ti)(ti)（BCR）來(lai)識別和(he)結合抗原，進而發揮功能清除病原體(ti)(ti)(ti)或體(ti)(ti)(ti)內腫(zhong)瘤細(xi)(xi)胞(bao)。免(mian)疫(yi)組(zu)庫(ku)是機體(ti)(ti)(ti)免(mian)疫(yi)系(xi)統(tong)的(de)完全反映，對(dui)免(mian)疫(yi)組(zu)庫(ku)分(fen)析，可以(yi)全面評估(gu)機體(ti)(ti)(ti)的(de)免(mian)疫(yi)狀態(tai)。
免疫組庫測序應用
免(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)組(zu)庫的(de)(de)全面(mian)測(ce)序為免(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)組(zu)庫多樣性(xing)(xing)變化特點(dian)的(de)(de)生物標志物發(fa)現、腫瘤等(deng)疾(ji)病(bing)療(liao)(liao)(liao)效預測(ce)、疾(ji)病(bing)的(de)(de)易感性(xing)(xing)和(he)抵抗(kang)性(xing)(xing)、感染(ran)性(xing)(xing)疾(ji)病(bing)及(ji)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)研究等(deng)方(fang)面(mian)帶來(lai)重(zhong)要進展。其中，在癌癥疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)單獨(du)用(yong)(yong)于(yu)微小殘(can)留(liu)病(bing)的(de)(de)治(zhi)療(liao)(liao)(liao)方(fang)面(mian)，通(tong)過(guo)探索阻滯免(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)檢(jian)測(ce)點(dian)或(huo)運用(yong)(yong)免(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)刺激(ji)劑(ji)的(de)(de)方(fang)式(shi)應(ying)用(yong)(yong)于(yu)轉移性(xing)(xing)疾(ji)病(bing)的(de)(de)治(zhi)療(liao)(liao)(liao)，嘗試多種聯合(he)方(fang)式(shi)，如化療(liao)(liao)(liao)藥(yao)(yao)物+疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)、疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)+生物標志物、疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)+IL微粒、疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)+佐(zuo)劑(ji)等(deng)，最終設(she)計(ji)優化出(chu)能夠(gou)取得(de)長期臨(lin)床效應(ying)的(de)(de)集成免(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)治(zhi)療(liao)(liao)(liao)方(fang)案。例如，在微小殘(can)留(liu)病(bing)檢(jian)測(ce)方(fang)面(mian)，白血(xue)(xue)病(bing)治(zhi)療(liao)(liao)(liao)后，常(chang)有微小殘(can)留(liu)病(bing)，流式(shi)細胞術(shu)基(ji)本檢(jian)測(ce)不到。利(li)用(yong)(yong)高通(tong)量測(ce)序分(fen)析免(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)組(zu)庫監控，對比(bi)正常(chang)人(ren)群的(de)(de)免(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)組(zu)庫和(he)白血(xue)(xue)病(bing)病(bing)人(ren)的(de)(de)免(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)組(zu)庫序列，通(tong)過(guo)大數據分(fen)析找(zhao)出(chu)白血(xue)(xue)病(bing)相關致病(bing)克(ke)隆，可以相對精確地判斷(duan)出(chu)病(bing)人(ren)體內(nei)白血(xue)(xue)病(bing)細胞數量，從而及(ji)時(shi)指導(dao)白血(xue)(xue)病(bing)的(de)(de)臨(lin)床治(zhi)療(liao)(liao)(liao)及(ji)用(yong)(yong)藥(yao)(yao)。
免(mian)(mian)疫(yi)組(zu)庫(ku)(ku)高通量測(ce)(ce)序(xu)是通過(guo)多重PCR或(huo)5′RACE法擴增TCR/BCR全(quan)長或(huo)CDR3區序(xu)列（主要是TCR的(de)(de)(de)β鏈(lian)或(huo)BCR的(de)(de)(de)重鏈(lian)），再結(jie)合(he)高通量測(ce)(ce)序(xu)技術，對(dui)機體(ti)免(mian)(mian)疫(yi)組(zu)庫(ku)(ku)的(de)(de)(de)多樣性(xing)及每種(zhong)T、B細(xi)胞克隆(long)的(de)(de)(de)獨特(te)性(xing)序(xu)列組(zu)成和變(bian)化進行分析，從而全(quan)面評估機體(ti)的(de)(de)(de)免(mian)(mian)疫(yi)狀態，明(ming)確(que)疾病(bing)與T、B細(xi)胞克隆(long)組(zu)成及變(bian)化之間的(de)(de)(de)關(guan)系。免(mian)(mian)疫(yi)組(zu)庫(ku)(ku)高通量測(ce)(ce)序(xu)技術強大(da)的(de)(de)(de)信息(xi)通量可大(da)大(da)提(ti)高抗原特(te)性(xing)異(yi)TCR和BCR鑒別的(de)(de)(de)效(xiao)率和準確(que)性(xing)，結(jie)合(he)免(mian)(mian)疫(yi)組(zu)庫(ku)(ku)高通量測(ce)(ce)序(xu)技術的(de)(de)(de)特(te)異(yi)性(xing)TCR/BCR鑒別技術必將得到廣泛應用和快速發展(zhan)，并大(da)大(da)提(ti)速免(mian)(mian)疫(yi)治(zhi)療(liao)領域的(de)(de)(de)進展(zhan)。
廣州(zhou)華銀健康科技(ji)有限(xian)公司(si)腫瘤(liu)(liu)精準(zhun)醫療高(gao)通量(liang)測(ce)序公共(gong)服(fu)務平臺(tai)，圍繞腫瘤(liu)(liu)精準(zhun)醫療開(kai)發出了(le)系(xi)(xi)列針對實體瘤(liu)(liu)藥(yao)物(wu)靶(ba)標(biao)(biao)基(ji)因檢(jian)測(ce)、遺傳性腫瘤(liu)(liu)基(ji)因檢(jian)測(ce)、血液腫瘤(liu)(liu)分(fen)子病理檢(jian)測(ce)、腫瘤(liu)(liu)基(ji)因組(zu)檢(jian)測(ce)、循環(huan)腫瘤(liu)(liu)DNA檢(jian)測(ce)、免(mian)疫組(zu)庫(ku)（TCR、BCR）高(gao)通量(liang)測(ce)序及分(fen)析(xi)等(deng)項目研發技(ji)術(shu)流程(cheng)，并建立對應的技(ji)術(shu)流程(cheng)及實驗室質量(liang)標(biao)(biao)準(zhun)化管理體系(xi)(xi)，定(ding)期開(kai)展國家衛計委室間質評活動。
服務包(bao)括：
1）測(ce)序數據(ju)質量評估：去除(chu)原始數據(ju)（raw data）中的無效序列(lie)，獲得(de)有效測(ce)序數據(ju)（clean data）
2）克隆(long)的(de)(de)(de)鑒定與(yu)計數(shu)：與(yu)IMGT數(shu)據庫比對(dui)(dui)，確定V、D、J基因片(pian)段(duan)，并(bing)對(dui)(dui)克隆(long)進行(xing)鑒定，去除組(zu)庫擴(kuo)增及(ji)高通量測序過程中引入(ru)的(de)(de)(de)錯誤(wu)序列，對(dui)(dui)得到的(de)(de)(de)可信序列計數(shu)，并(bing)以(yi)EXCEL表(biao)格(ge)的(de)(de)(de)形式提供(gong)給研(yan)究者（如表(biao)1），便于研(yan)究者結(jie)合項目(mu)的(de)(de)(de)臨床(chuang)數(shu)據進行(xing)深(shen)入(ru)的(de)(de)(de)分(fen)組(zu)分(fen)類統(tong)計分(fen)析，如比較疾病組(zu)與(yu)對(dui)(dui)照組(zu)V、J等基因種(zhong)類組(zu)成(cheng)的(de)(de)(de)差異。
表1. 文庫測(ce)序結(jie)果分類計數
3）不同V/D/J基因(yin)使(shi)用頻(pin)率：對每個樣本中鑒定到的(de)(de)V、D、J基因(yin)進行計(ji)數和頻(pin)率的(de)(de)計(ji)算并(bing)繪圖(tu)（如圖(tu)1），統(tong)計(ji)分(fen)析(xi)找出頻(pin)率上有顯著差異的(de)(de)V、D、J基因(yin)，并(bing)以EXCEL表格的(de)(de)形(xing)式提供(gong)給(gei)研究者，便于進一步分(fen)類(lei)統(tong)計(ji)分(fen)析(xi)。
圖(tu)1. V基(ji)因(yin)使用(yong)頻(pin)率
4）不同(tong)V/D/J基(ji)因(yin)組合(he)頻率(lv)：對每個樣本中(zhong)鑒(jian)定到(dao)的(de)V和(he)(he)J基(ji)因(yin)組合(he)以(yi)及(ji)V、D和(he)(he)J基(ji)因(yin)組合(he)進行計(ji)(ji)數和(he)(he)頻率(lv)的(de)計(ji)(ji)算(suan)，統(tong)(tong)計(ji)(ji)分(fen)析找出頻率(lv)上有顯著(zhu)差異的(de)V和(he)(he)J基(ji)因(yin)組合(he)以(yi)及(ji)V、D和(he)(he)J基(ji)因(yin)組合(he)，并以(yi)EXCEL表格的(de)形式提供給研究者(zhe)（如下圖），便于進一步分(fen)類統(tong)(tong)計(ji)(ji)分(fen)析。
表2.V和J基因組合(he)
表3.V、D和(he)J基因組合(he)
5）獨(du)(du)特克隆(long)型頻(pin)(pin)率(lv)：對每(mei)個(ge)樣(yang)本(ben)中鑒定到的(de)獨(du)(du)特克隆(long)型（unique clonotype）CDR3核(he)苷酸及氨基酸序列進行(xing)計數和(he)頻(pin)(pin)率(lv)的(de)計算(suan)，并以EXCEL表格的(de)形式提供給研(yan)究者（表1），便于研(yan)究者結合樣(yang)本(ben)的(de)臨床數據進行(xing)深入的(de)分(fen)(fen)組分(fen)(fen)類統計分(fen)(fen)析(xi)，如獨(du)(du)特CDR3克隆(long)型數量(liang)的(de)差異、獨(du)(du)特克隆(long)型數量(liang)與臨床資料包括年齡(ling)性(xing)別(bie)等(deng)的(de)差異等(deng)。對每(mei)個(ge)樣(yang)本(ben)獨(du)(du)特CDR3克隆(long)所占百分(fen)(fen)比頻(pin)(pin)率(lv)繪(hui)圖，統計前5個(ge)最(zui)高頻(pin)(pin)率(lv)克隆(long)所占比例（圖2）。
圖2.獨(du)特CDR3克隆所占百分比頻(pin)率
6）CDR3長度(du)分(fen)布(bu)：對每個樣本中鑒定到的獨特克隆型，分(fen)析其CDR3氨(an)基酸的長度(du)分(fen)布(bu)（圖3）。
圖3.CDR3氨基酸的長度分布
7）樣(yang)(yang)本間(jian)CDR3氨基(ji)酸序列的相關性、相似性和多(duo)樣(yang)(yang)性評估：根(gen)據樣(yang)(yang)本間(jian)獨特(te)CDR3氨基(ji)酸序列計(ji)算樣(yang)(yang)本間(jian)文庫的相關性和相似性（圖4），評估比較樣(yang)(yang)本組間(jian)獨特(te)CDR3克隆多(duo)樣(yang)(yang)性差異（圖5）。
圖4.樣(yang)本間文庫的相關性
圖5.樣本組間獨特CDR3克隆多樣性差異
8）樣(yang)本(ben)(ben)間共有(you)克隆分析：根據樣(yang)本(ben)(ben)間獨特CDR3氨基(ji)(ji)酸(suan)(suan)序(xu)列計算(suan)樣(yang)本(ben)(ben)共有(you)VDJ基(ji)(ji)因組合及CDR3氨基(ji)(ji)酸(suan)(suan)序(xu)列的數量和比(bi)例(li)（圖6、7、8）。
圖6.同(tong)(tong)一患者不(bu)同(tong)(tong)部位樣本V/D/J基(ji)因組合的共有克隆(long)及所占比例(li)
圖7. 同一(yi)患者不(bu)同部位樣本CDR3氨基酸(suan)序(xu)列(lie)共有克隆及(ji)所占比例
圖8.全部樣本中CDR3氨基酸(suan)序(xu)列共有克隆及所(suo)占比例
華銀免(mian)疫組庫高通量(liang)測(ce)序及(ji)分析技(ji)術優勢(shi)：
1）由武漢大(da)(da)學、中山大(da)(da)學、南方醫科大(da)(da)學以及美國斯(si)坦福(fu)大(da)(da)學研究(jiu)人員組(zu)成(cheng)的(de)專(zhuan)業(ye)的(de)研究(jiu)和分析團(tuan)隊，保證(zheng)研究(jiu)結果(guo)的(de)可信度(du)和可重復(fu)性(xing)；
2）用(yong)免疫組庫擴增(zeng)最(zui)可靠的5′RACE法，保證結果的可靠性(xing)(xing)和后(hou)期研究(jiu)的方便(bian)性(xing)(xing)；
3）用最優選最可靠的(de)擴增和(he)建庫試劑，保證(zheng)組庫序列擴增的(de)保真(zhen)性和(he)擴增效率；
4） 針(zhen)對(dui)不(bu)同樣品類型（細(xi)胞、組織、全血），不(bu)同濃度梯度細(xi)胞數（100個以(yi)上(shang)淋(lin)巴(ba)細(xi)胞）均可建庫測序；
5） 運(yun)用國際認可的(de)專(zhuan)業的(de)免疫組庫分(fen)析(xi)(xi)模塊，并結合我們(men)自己獨有的(de)生物信息分(fen)析(xi)(xi)算法，所提供(gong)的(de)標準化(hua)的(de)分(fen)析(xi)(xi)流程即可滿足(zu)科研或(huo)臨床所需。另外我們(men)還可提供(gong)數(shu)據的(de)深度分(fen)析(xi)(xi)服務；
6） 根(gen)據項目研究(jiu)目的不(bu)同，可(ke)選擇(ze)不(bu)同的測序平(ping)臺（MiSeq或HiSeq）和(he)策略，從(cong)而節約經(jing)費，得(de)到最(zui)滿意的性價比；
7） 可提供外周(zhou)血單個(ge)核細胞（PBMC）的分(fen)離(li)、特異性(xing)淋(lin)巴細胞的分(fen)選；
華(hua)銀高通(tong)(tong)(tong)量(liang)測序服(fu)(fu)務(wu)(wu)平臺自是(shi)廣東省唯一一家擁有豐(feng)富醫學(xue)背景提(ti)供科(ke)研(yan)高通(tong)(tong)(tong)量(liang)測序服(fu)(fu)務(wu)(wu)的(de)(de)企業。平臺已獲(huo)得CNAS ISO15189醫學(xue)實(shi)驗(yan)室國際質量(liang)認可、美國CAP實(shi)驗(yan)室認可，不僅可以提(ti)供可靠的(de)(de)測序數據(ju)，還(huan)可以量(liang)身(shen)定做的(de)(de)數據(ju)分析服(fu)(fu)務(wu)(wu)，為醫學(xue)科(ke)研(yan)疾病研(yan)究(jiu)提(ti)供全方位服(fu)(fu)務(wu)(wu)，從上(shang)游的(de)(de)高通(tong)(tong)(tong)量(liang)篩(shai)選(xuan)和下游的(de)(de)基因分子機制功能研(yan)究(jiu)甚至(zhi)到(dao)臨(lin)床轉化(hua)的(de)(de)合作，我們都可以參與提(ti)供貼心周到(dao)的(de)(de)服(fu)(fu)務(wu)(wu)。
目(mu)前(qian)華(hua)銀(yin)高通量測序服(fu)(fu)務(wu)(wu)平(ping)臺(tai)為推進免(mian)疫組庫的(de)臨床項(xiang)目(mu)的(de)研發(fa)與轉化應用，為推動(dong)(dong)精(jing)準醫學、醫學檢測外包(bao)服(fu)(fu)務(wu)(wu)及相關醫療產業(ye)的(de)發(fa)展(zhan)提供技(ji)術支持(chi)，對免(mian)疫組庫測序服(fu)(fu)務(wu)(wu)提供買三(san)送(song)(song)一(yi)活(huo)動(dong)(dong)，即向華(hua)銀(yin)送(song)(song)檢測序分(fen)析三(san)個樣品，免(mian)費獲贈一(yi)個樣品服(fu)(fu)務(wu)(wu)。截止(zhi)時間為7月30日(ri)。 服務詳情咨(zi)詢：董(dong)老師 020-38917464。
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